Пцр на скрытые инфекции

Диагностика методом ПЦР на скрытые инфекции выявит их в начале развития

Как правило, скрытыми называют инфекции, передающиеся половым путём, например, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз. Гонорея, сифилис, трихомониаз, вирус папилломы человека также относят к скрытым инфекциям, поскольку они протекают бессимптомно в течение многих месяцев. Сюда же можно отнести вирус герпеса, цитомегаловирус.

Возбудители всех этих заболеваний так быстро мутируют и приспосабливаются к изменениям окружающей среды, что диагностировать их становится всё сложнее. Поэтому, наряду с уже привычными методиками, применяют новые технологии диагностики.

Анализ ПЦР на скрытые инфекции на сегодняшний день является одним из самых точных и быстрых исследований. Аббревиатура ПЦР расшифровывается как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном удвоении конкретного участка ДНК или РНК вируса возбудителя и иногда даже выявления его отдельных клеток. Анализ способен выявить возбудителя, даже если его содержится минимальное количество, а, значит, выявить заболевание в самом его начале.

Скрытые инфекции опасны не только своим влиянием на здоровье их носителей, но и на здоровье их будущих детей. Сдать анализ ПЦР на скрытые инфекции рекомендуется всем супружеским парам, планирующим зачатие ребёнка. Он позволит выявить инфекции у обоих родителей и не допустить заражения плода. С помощью ПЦР можно исследовать любые ткани и биоматериалы человеческого организма (кровь, моча, слюна, мокрота, эпителий).

Исследование методом ПЦР помогает выявить вирус ВИЧ и других инфекций, например, гепатита С, туберкулёза лёгких и других органов, инфекций органов пищеварения.

ПЦР анализ на скрытые инфекции и не только (полимеразная цепная реакция)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) нашла широкое применение во многих областях генетического анализа. Вот список некоторых возможностей ее применения:

ПЦР применяется в большом количестве медицинских процедур:

Первое применение ПЦР было использовано для генетического тестирования, когда образец ДНК анализировали на наличие заболеваний генетических мутаций. Будущие родители могут сдать анализы, чтобы узнать, являются ли они генетическими носителями, либо их дети могут сдать анализы, чтобы узнать, подвержены ли они на самом деле заболеванию. Образцы ДНК для пренатальных анализов можно получить путем амниоцентеза, биопсии хориона, или даже путем анализа редких клеток плода, циркулирующих в крови матери. Анализ ПЦР также необходим для предимплантационной генетической диагностики, когда отдельные клетки развивающегося эмбриона анализируются на наличие мутаций.

ПЦР также может быть использована как часть точных анализов для тканевого типирования, жизненно важного для трансплантации органов. В 2008 году даже поступило предложение заменить традиционные анализы на основе антител на анализы типа крови, основывающиеся на ПЦР.
Многие формы рака связаны с изменением онкогенов. Используя анализы ПЦР для изучения этих мутаций, иногда можно индивидуально изменить схемы терапии для конкретного пациента.

Анализ полимеразной цепной реакции на инфекции

С помощью ПЦР была революционно улучшена характеристика и обнаружение возбудителей инфекций:

Вирус иммунодефицита человека (или ВИЧ), ответственный за возникновение СПИДа, трудно найти и уничтожить. Самые ранние анализы инфекции опирались на наличие антител к вирусу, циркулирующих в крови. Однако антитела появляются только спустя несколько недель после заражения, материнские антитела маскируют инфекцию у новорожденных, а терапевтические средства для борьбы с инфекцией не влияют на антитела. Были разработаны анализы ПЦР, которые могут обнаружить даже один вирусный геном среди ДНК более 50000 клеток-хозяев. Инфекции могут быть обнаружены ранее, донорскую кровь можно проверить непосредственно на вирус, у новорожденных можно немедленно взять анализы на скрытые инфекции, а эффекты противовирусного лечения можно определить количественно.
Некоторые болезнетворные организмы, например, те, которые вызывают туберкулез, трудно взять у пациентов и слишком долго выращивать в лабораторных условиях. Анализы ПЦР позволили обнаружить небольшое количество болезнетворных организмов (как живых, так и мертвых), в удобных пробах. Детальный генетический анализ также можно использовать для обнаружения резистентности к антибиотикам, что позволяет начать немедленное и эффективное лечение. Эффекты терапии также стало возможно оценить сразу.
Распространение болезнетворных организмов в популяциях домашних или диких животных можно контролировать с помощью анализов ПЦР. Во многих случаях появление новых вирулентных подтипов можно обнаружить и мониторить. Подтипы организма, которые вызвали предыдущие эпидемии, также можно определить с помощью анализа ПЦР.

Применение ПЦР в судебной отрасли

Разработка протоколов дактилоскопии на основе генетики ПЦР (или ДНК) нашла широкое применение в криминалистике:

В самой дифференциальной форме генетические отпечатки пальцев могут однозначно отличить одного человека от всего населения мира. Образцы ДНК можно быстро взять на месте преступления и сравнить с ДНК подозреваемых или с базой данных ДНК предыдущих свидетелей или осужденных. Часто делают более простые версии этих анализов, чтобы быстро проверить подозреваемых в ходе расследования уголовного дела. Данные преступлений многолетней давности могут быть проверены, при этом подтвердится или будет доказана невиновность первоначально осужденных людей.
Менее подробные формы ДНК-дактилоскопии могут помочь при анализах на отцовство, когда отдельного человека сравнивают с его близкими родственниками. Можно проверить ДНК останков неизвестного человека и сравнить с ДНК возможных родителей, братьев, сестер или детей. Похожие анализы могу использоваться для подтверждения биологических родителей усыновленного (или похищенного) ребенка. Также можно подтвердить (или опровергнуть) настоящего биологического отца новорожденного.

Применение в исследованиях

ПЦР применяется во многих областях исследования молекулярной генетики:

ПЦР позволяет быстро производить короткие фрагменты ДНК, даже если известно не более чем одна последовательность двух праймеров. Эта способность ПЦР позволяет осуществлять множество методов, таких как генерация и гибридизация ДНК-зонда для гибридизации саузерн-блота или нозерн-блота. ПЦР обеспечивает эти методы большим количеством чистой ДНК, иногда одной цепи, что позволяет анализ даже при очень малом количестве исходного материала.
Задача секвенирования ДНК может также быть облегчена с помощью ПЦР. Известные сегменты ДНК можно легко получить у пациентов с заболеваниями генетической мутации. Изменения в технике усиления могут выделить сегменты с совершенно неизвестным геном, или могут создать только одну цепь в интересующей области.
ПЦР имеет многочисленное применение в более традиционном процессе клонирования ДНК. Она может извлечь сегменты для вставки в вектор из большего генома, который может быть доступен только в небольших количествах. Используя единый набор «векторов-праймеров», ПЦР также может анализировать и извлекать фрагменты, которые уже были вставлены в векторы. Некоторые изменения в протоколе ПЦР могут генерировать мутации (общие или направленные на определенную область) вставленного фрагмента.
ДНК маркирующий сайт является процессом, в котором ПЦР используется как показатель того, что определенный сегмент генома присутствует в том или ином клоне. Проект «Геном человека» считает, что такое применение имеет жизненно важное значение для отображения космидных клонов и для координации результатов, полученных в разных лабораториях.
Захватывающим применением ПЦР является филогенетический анализ ДНК, полученной из древних источников, таких, которые находят в обнаруженной кости неандертальцев или в замороженных тканях мамонтов. В некоторых случаях сильно деградированная ДНК из этих источников может быть собрана во время ранних стадий усиления.
Распространенным применением ПЦР является изучение закономерностей экспрессии генов. Ткани (или даже отдельные клетки) можно проанализировать на разных этапах, чтобы посмотреть, какие гены стали активными или какие стали выключены. Такое применение также можно использовать для ПЦР в реальном времени для количественного определения фактического уровня экспрессии.
Способность ПЦР одновременно усиливать несколько локусов отдельных сперматозоидов значительно расширила более традиционную задачу генетического картирования путем изучения хромосомных кроссоверов после мейоза. Редкие события кроссовера между очень близкими локусами можно было непосредственно наблюдать, анализируя тысячи отдельных сперматозоидов. Кроме того, можно проанализировать необычные делеции, вставки, транслокации и инверсии без необходимости ждать (или оплачивать) долгий и трудоемкий процесс оплодотворения, эмбриогенеза и т.д.

Другие области использования ПЦР

ПЦР также важна для ответов на основные научные вопросы. В области эволюционной биологии ПЦР была использована для установления взаимосвязи между видами. В антропологии она была использована, чтобы понять миграции древнего человека. В археологии она использовалась, чтобы помочь идентифицировать древние человеческие останки. Палеонтологи использовали ПЦР для амплификации ДНК вымерших насекомых, которые сохранились в янтаре в течение 20 миллионов лет. Проект генома человека, который имел целью определение последовательности 3 миллиардов пар оснований в геноме человека, полагался на ПЦР. Гены, ответственные за различные заболевания человека, были идентифицированы с помощью ПЦР. Например, метод ПЦР, называющийся мультиплексной ПЦР, выявляет мутации в генах у мальчиков, страдающих от мышечной дистрофии Дюшенна. ПЦР также может быть использована для поиска ДНК чужеродных организмов, таких как вирусы или бактерии.

ПЦР анализ в диагностике различных инфекций: что это такое, как подготовиться к анализу, что могут означать его результаты

Для проведения ПЦР могут быть использованы различные биологические материалы, в которых могут содержаться микробы или их фрагменты.

Для выявления инфекций половых органов у мужчин и женщин, для анализа берутся выделения из половых органов, мазок из мочеиспускательного канала, мазок из шейки матки, а также моча.

Для диагностики вирусного гепатита С и ВИЧ инфекции на анализ берут кровь.

Для диагностики инфекционного мононуклеоза может быть использован мазок из зева.

Перед обследованием обязательно уточните у вашего врача, какие именно материалы будут использованы для анализа.

Толкование и расшифровка результатов ПЦР

Возможны следующие результаты ПЦР анализа:

Отрицательный результат – означает, что в биологическом материале, который был подвержен исследованию, не было обнаружено никаких следов инфекции. В большинстве случаев отрицательный результат анализа ПЦР говорит о том, что в организме человека нет инфекции, следы которой пытались обнаружить при помощи обследования.

Положительный результат – означает, что в биологическом материале, который был подвержен исследованию, были обнаружены следы инфекции. Положительный результат ПЦР с большой степенью точности указывает на наличие той или иной инфекции.

Насколько точна ПЦР диагностика инфекций?

Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен:

точно определить наличие или отсутствие инфекции;
точно указать, что именно это за инфекция (специфичность);
обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале, который был подвергнут исследованию (чувствительность).

В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА) и других иммунологических методов диагностики инфекции, ПЦР гораздо реже дает ложно-отрицательные результаты (анализ показывает отсутствие инфекции в то время когда на самом деле она есть) и практически никогда не дает ложно-положительные результаты (анализ показывает наличие инфекции в то время когда на самом деле ее нет).

ПЦР анализ на скрытые инфекции и не только

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это техника, которая используется для увеличения микроколичеств ДНК (и в некоторых случаях РНК), расположенных почти в каждой жидкости или на поверхности, где могут быть отложены цепочки ДНК. Ключ к пониманию ПЦР – это знание того, что каждый человек, животное, растение, паразит, бактерия или вирус содержит генетический материал, такой как последовательности ДНК (или РНК) (нуклеотидные последовательности или кусочки ДНК или РНК), которые уникальны для своих видов и для отдельных представителей этих видов. Следовательно, если образец содержит сегменты ДНК или РНК, ПЦР – это метод, используемый для амплификации (образования намного большего числа идентичных копий) этих уникальных последовательностей, чтобы они затем могли использоваться для определения с очень высокой вероятностью идентичности источника (определенного человека, животного или патогенного организма) следа ДНК или РНК, обнаруженного почти на каждом образце материала.

Однако, амплификация ПЦР – это только часть анализа определения. Когда амплификация сделана, расширенные сегменты нужно сравнить с другими нуклеотидными сегментами от известного источника (например, определенного человека, животного или патогенного организма). Это сравнение уникальных сегментов часто проводится путем помещения генерированных ПЦР нуклеотидных сегментов, смежных с известными нуклеотидными последовательностями от людей, патогенов или других источников в фильтрующем геле. Через гель пропускается электрический ток, и различные нуклеотидные последовательности формируют полосы, которые напоминают «лестницу», в соответствии со своими электрическими зарядами и размерами молекул. Это называется электрофорезом в геле. Полосы или «ленты», как ступени, которые перемещаются к тем же уровням в геле, показывают идентичность нуклеотидных последовательностей. Этот метод является одним из самых популярных способов проведения анализов ПЦР.

Как осуществляется ПЦР (полимеразная цепная реакция)?

В 1983 г. Кэри Маллис вывел основные этапы амплификации последовательностей ДНК. В 1993 г. его вместе с Майклом Смитом наградили Нобелевской премией за разработку этой процедуры. Существует несколько основных этапов, которым следуют в последовательности; ПЦР может быть проведена в одной пробирке с подходящими химическими веществами и специально разработанным нагревателем. Нужны следующие реагенты или химические вещества:

Образец, содержащий нуклеотидную последовательность (из крови, волос, гноя, кожного соскоба и т.д.);
ДНК-праймеры: короткая одноцепочная ДНК, присоединяющаяся к нуклеотидным последовательностям, которые способствуют синтезу дополнительной цепочки нуклеотидов;
ДНК-полимераза: когда ДНК имеет связь праймера, этот фермент сходит вниз по сегменту ДНК, присоединяясь к строительным блокам ДНК для формирования дополнительных основных пар, и тем самым синтезирует дополнительную нуклеотидную цепочку ДНК (введение теплоустойчивой ДНК-полимеразы, Taq-полимеразы, полученной от теплоустойчивой бактерии, явно улучшило способность проведения ПЦР);
В растворе присутствует большой избыток строительных блоков ДНК, называемых нуклеотидами (аденин, тимидин, цитозин и гуанин, которые сокращенно определяют, как А, Т, Ц и Г, соответственно). Когда эти блоки связываются вместе, они образуют нуклеотидную последовательность или единую цепочку ДНК. Когда эти строительные блоки связываются с их дополнительным строительным блоком слабыми водородными связями (например, А связывается только с Т, а Г – только с Ц), образуется добавочная нуклеотидная последовательность ДНК и связывается с оригинальной одноцепочной ДНК. Когда связывание завершается, образуется дополнительная двухцепочная ДНК в специфической последовательности.

Затем ПЦР начинается с сегмента ДНК от образца, помещенного в пробирку с перечисленными выше реагентами. Раствор нагревается, по крайней мере, до 94°C. Это тепло разрушает водородные связи, которые позволяют формирование дополнительных нитей ДНК, поэтому в смеси существуют только единые цепочки (это называется денатурацией двухцепочной ДНК).

Смеси дают остыть приблизительно до 54°C. При этой температуре ДНК-праймеры и ДНК-полимераза связываются до отдельной одноцепочной ДНК (это называется ренатурацией ДНК). Так как в смеси имеется избыток (высокая концентрация) строительных блоков, полимераза использует их для образования новых дополнительных цепочек ДНК (это называется удлинением ДНК), и этот процесс проходит быстрее при 72°C. Этот процесс создает новые молекулы двухцепочной ДНК от каждой цепочки оригинальной молекулы.

Это цикл повторяется приблизительно 40 раз в машине под названием термоблок для проведения реакций, который автоматически повторяет циклы нагрева и охлаждения, где количество каждой последовательности ДНК удваивается каждый раз, когда завершается цикл нагрева и охлаждения. То, что изначально было одним коротким сегментом ДНК, можно увеличить до почти 100 миллиардов копий после 40 циклов дублирования.

Почему врач заказывает анализ ПЦР (полимеразной цепной реакции)?

Анализ ПЦР образует основу ряда анализов, которые могут ответить на многие разные медицинские вопросы, которые помогают терапевтам диагностировать и лечить своих пациентов. Например, анализы ПЦР могут определить и установить патогенные организмы у пациентов, особенно, те, что трудно культивировать (например, ВИЧ и другие вирусы, а также определенные грибки).

Другие врачи заказывают анализы ПЦР, чтобы помочь диагностировать генетические заболевания, в то время как другие врачи используют ПЦР для определения биологических связей, например, установления родителей детей. Анализы ПЦР также используются для определения и описания генетических мутаций и перегруппировки, обнаруживаемых в некоторых видах рака.

Однако анализы ПЦР были изменены и расширены во многих аспектах научных исследований, включая эволюционную биологию, генетическую дактилоскопию, судебных расследованиях и многих других.

Что такое ОТ-ПЦР?

ОТ-ПЦР – это анализ ПЦР для определения и измерения РНК. Хотя первоначальные анализы ПЦР увеличивали ДНК, многие вирусы и другие биологические компоненты (например, митохондрии) используют РНК в качестве своего генетического материала. ОТ-ПЦР отличается от традиционной ПЦР, в этом анализе сначала берется РНК, и цепочка РНК превращается в цепочку ДНК. Это выполняется по существу тем же методом для ПЦР, описанным выше, за исключением использования фермента под названием обратная транскриптаза вместо ДНК-полимеразы. Обратная транскриптаза позволяет одной цепочке РНК превратиться в дополнительную цепочку ДНК. Когда произойдет эта реакция, затем может быть использован обычный метод ПЦР для амплификации ДНК. ОТ-ПЦР использовалась для определения и изучения многих вирусов РНК.

ОТ-ПЦР не следует путать с другой разновидностью ПЦР под названием ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени – это вариация ПЦР, которая позволяет анализ увеличенной ДНК в ходе обычных 40 циклов процедуры. Хотя процедура аналогична традиционной ПЦР с чередованием, ПЦР в реальном времени использует флуоресцентные красители, присоединенные к некоторым строительным блокам или маленьким нуклеотидным цепочкам. В зависимости от используемого метода возникает свечение, когда образуются расширенные цепочки ДНК. Объем свечения можно измерить на протяжении 40 циклов, и это позволяет исследователям измерять специфические продукты и их количество во время циклов амплификации. Это часто позволяет исследователям или лабораторным техникам пропускать электрофорез в геле или другие вторичные процедуры, нужные для анализа продуктов ПЦР, тем самым получая быстрее результаты.

ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР – это разновидности модификаций оригинального анализа ПЦР. Однако существует много других разновидностей (по крайней мере, 25), которые используются для решения особых проблем. Они все имеют разные имена, такие как ПЦР совокупности, ПЦР с «горячего старта», мультиплексная ПЦР, ПЦР твердой фазы и многие другие.

Вероятно, будет продолжена модификация ПЦР, чтобы помочь ответить на многие другие ответы в медицине, биологии и других областях исследования.