Главная » Статьи » Что такое пцр

Что такое пцр


ПЦР: что это такое?

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

 ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

 Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут. 

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

 Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО  в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК – рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти?ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Просмотров: 3859

ЖЕНСКОЕ ЗДОРОВЬЕ

С середины 90-х гг. в практической медицине стал широко применяться но­вый диагностический подход, основанный на применении метода ПЦР (полимеразная цепная реакция).

На данный момент в России и странах СНГ активно функционируют более 1000 лабораторий, применяющих на практике метод ПЦР. За этот период метод ПЦР как один из методов клинической лабораторной диагностики прошел несколь­ко этапов развития, в том числе несколько этапов становления и утверждения в практическом здравоохранении.

Некоторое время тому назад, среди медицинской общественности было широко распространено несколько эйфорическое отношение к ПЦР-методу, как к некоей панацее, «самому-самому» методу диагностики, способному решить сра­зу много вопросов и применимому во всех областях.

Через определенное время стало понятно, что ПЦР – всего лишь один из методов лабораторной диагностики, но даже новый замечательный метод, име­ющий много преимуществ, не может решить всех проблем, и кроме того, имеет ряд существенных ограничений. Помимо всего, как грибы стали возникать фирмы и лаборатории, выпускающие наборы реагентов для ПЦР, зачастую не отвечаю­щие требованиям по качеству, а широкомасштабная неумелая реклама только усилила эффект последующего разочарования. Эти обстоятельства привели к тому, что в некоторых кругах региональной медицинской общественности метод ПЦР (а точнее его первоначальное практическое воплощение) до сих пор ассо­циируется с какой-то разновидностью шарлатанства.

Однако, к настоящему моменту метод ПЦР:

-занял прочную позицию в ряду диагностических методик;

-получил официальное признание в виде утвержденной номенклатуры кли­нических лабораторных исследований;

-претерпел существенные изменения в области оптимизации проведения анализа, усовершенствования аппаратурного оборудования, повышения качества и надежности выпускаемых тест-систем.

Методы  выявления  ДНК  и  РНК-возбудителей  в  настоящее  время  применяют  в  основном  для  диагностики  вирусных инфекций. Методы генной диагностики базируются на выявлении нуклеотидных последовательностей непосредственно в патологическом материале с помощью молекулярных зондов — искусственно полученных нуклеиновых кислот, комплементарных вирусным нуклеиновым кислотам и меченных биотином или радиоактивной меткой. 

Особенность метода ПЦР — многократное копирование (амплификация, репликация, удвоение) с помощью фермента ДНК-полимеразы определённого фрагмента ДНК, состоящего из нескольких десятков или сотен нуклеотидных пар, который уникален, то есть специфичен для  данного вида возбудителя. Механизм репликации таков, что достраивание фрагмента  может начаться только в определённых стартовых блоках, для создания которых в заданных участках ДНК используют затравки (праймеры) — специально синтезированные олигонуклеотиды. Праймеры  комплементарны последовательностям в пределах границ специфического  фрагмента, и синтез ДНК протекает только в этих границах. Специфичность метода определяется выбором определяемого фрагмента (как правило, выбирается наиболее консервативный участок генома возбудите­ля, не подверженный мутациям) и подбором олигонуклеотидных затравок (праймеров) к границам искомого фрагмента. Специфичность декларируется произ­водителем тест-системы как одна из важнейших характеристик.

Процесс ПЦР заключается в большом числе циклов синтеза (амплификации) специфического фрагмента ДНК, накоплении большого  числа  копий,  которые  затем  могут  быть  выявлены  обычными  методами  детекции  (иммунофлюоресцентный  анализ, электрофорез).

Преимущества ПЦРдиагностики: 

●простота исполнения;

●возможность полной автоматизации;

●быстрота получения результата;

●малое количество патологического материала, необходимого для исследования;

●возможность диагностики острых, хронических, латентных инфекций;

●выявление некультивируемых, персистирующих форм патогенов.

По  чувствительности  ПЦР  наиболее  совершенен  как  диагностический  метод  (на  несколько порядков выше, чем другие тесты). Специфичность метода также высока, но пока большинство тест-систем недостаточно надёжны, чтобы вытеснить классические методики при диагностике даже абсолютных патогенов.

Что  касается  оппортунистических  инфекций, то значение молекулярно-генетических методов диагностики пока нельзя признать сколько-нибудь значимыми, так как определяющим моментом в развитии таких воспалительных процессов служит количественный фактор, а не само по себе присутствие микроорганизма в обследуемом локусе.

В настоящее время ПЦР-методы широко используют в диагностике вирусных, паразитарных и бактериальных ИППП, чаще в  качестве  первичного  скрининга, а также контроля излеченности в сочетании с  другими методами лабораторной диагностики.

Каково же на современном этапе положение метода ПЦР в ряду лабора­торных диагностических методик:

Задачей метода ПЦР является выявление специфического участка ДНК или РНК путем получения большого количества копий данного участка, которые мож­но определить доступными лабораторными методиками. Несмотря на достаточно широкий круг возможного использования (диагностика наследственных заболе­ваний, идентификация личности, определение комплексов гистосовместимости тканей и др.), в основном метод ПЦР нашел применение для выявления возбуди­телей инфекционных заболеваний.

Такое широкое применение именно для диагностики инфекций обусловле­но:

1.    простотой и универсальностью метода;

2.    возможностью определения возбудителя с очень высокой специфичностью (до 100%), т.е способностью выявлять ДНК только искомого микроорганизма в клиническом образце, содержащем большую нагрузку по человеческой ДНК, ДНК других возбудителей, белкам и пр.

3. высокой чувствительностью, которая обеспечивает возможность выяв­ления единичных клеток или частиц возбудителя.

Что такое ПЦР диагностика?

Выявление возбудителей заболеваний сопровождается сдачей анализов. Мы с трудом читаем на направлении непонятные слова. Часто встречается такой метод лабораторной диагностики, как полимеразная цепная реакция. Что такое ПЦР? Давайте будем разбираться.

История

Метод был создан Кэри Мюллисом в 1983 году. За него ученого наградили Нобелевской премией. Изначально метод планировался для использования в научных целях, но, разглядев его эффективность и перспективность, стали продвигать новшество в практическую медицину.

Иногда на вопрос: «Что такое ПЦР?» отвечают, что это методика нахождения иглы в стоге сена. Под иглой здесь понимается фрагмент генетического материала микроорганизма, а сено – организм человека.

Принцип работы

В организме ДНК отвечает за генетическую информацию. Нуклеотиды соседних спиралей соединяются в установленном порядке. Своя ДНК есть у каждого живого организма - неважно, человек это, животное, вирус или бактерия. Для выявления организма нужен маленький участок генетического хранилища. Бывает, что микроорганизмы (вирус иммунодефицита) информацию хранят в рибонуклеиновой кислоте, но и ее фрагменты этот метод находит.

Вы до сих пор не поняли, что такое ПЦР и как она работает? Знайте, принцип ее построен на обнаружении уникального участка. Ведь для всех возбудителей существуют специфические генетические детекторы, эталонные фрагменты ДНК. Они улавливают «свой кусочек» и запускают реакцию создания копий.

За три минуты (один цикл) количество копий вырастает в разы. А за несколько часов число фрагментов увеличивается в миллиарды раз. Поэтому можно легко определить возбудителя инфекции.

Отвечая на вопрос, что такое ПЦР, нельзя не затронуть плюсы и минусы этого метода.

Достоинства:

  • Универсальность. Когда бессильны другие способы, анализ ПЦР могуч. Он обнаруживает любые РНК и ДНК на стандартном оборудовании.

  • Высокая специфичность. Последовательность нуклеотидов характерна только для одного конкретного возбудителя. То есть гарантия составляет 100%. Также исследуемый материал может быть направлен на выявление нескольких микроорганизмов одновременно. От этого не страдает качество ответа.

  • Чувствительность. Можно найти мельчайший фрагмент микроорганизма.

  • Оперативность. ПЦР – это диагностика за несколько часов. От сдачи материала до получения результата нужно не более одного дня.

  • Определение возбудителя в инкубационном периоде. Даже если нет видимых признаков болезни, метод сможет диагностировать возбудителя и определить заболевание.

Недостатки

«ПЦР – что это такое?» - спрашивают неосведомленные. Но мы уже знаем, что это результативный метод поиска инфекционного возбудителя. К сожалению, у него есть и недостатки. Например, бывает «ложное срабатывание», так как в воздухе находится коктейль из фрагментов ДНК многих живых организмов - и при проведении реакции образец может «загрязниться». Для предотвращения этого в помещении устанавливают фильтр биологической очистки.

Оценивать результаты анализов должен специалист. Так как положительный ответ не всегда означает наличие заболевания. Некоторые остаточные возбудители после лечения живут в организме еще несколько месяцев, не причиняя вреда. Невысокий титр показывает, что в жизни человек когда-то сталкивался с этим микроорганизмом.

Отрицательный анализ при наличии явной картины заболевания говорит о том, что материал был взят неправильно (не оттуда или не по инструкции).

Если вы сомневаетесь в результатах анализа, пересдайте их другим методом или в другой лаборатории. Совокупность нескольких способов дает 100% оценку организма на наличие или отсутствие инфекционных возбудителей. И помните: все результаты лабораторных исследований нужно показать врачу. Не делайте самостоятельных выводов и не ставьте себе диагнозы!

Что такое ПЦР?

В современном мире диагностировать инфекционные заболевания, заражение которыми происходит самым распространенным — половым путем стало просто как никогда. Анализ-ПЦР позволяет эффективно, со стопроцентной точностью выявить наличие заболевание на начальной стадии его развития.

Описание

Анализ — полимеразная цепная реакция имеет аббревиатуру — ПЦР. Такая ДНК технология назначается, если есть подозрение на какую-либо инфекцию, например, уреплазмоз (parvum). Выявить наличие некоторых микроорганизмов в обычных лабораторных условиях иногда бывает трудно, поэтому необходимо сдать этот анализ. Такая инфекция как parvum может очень долго существовать и размножаться в организме человека, вызывая хронические заболевания.

ДНК технология ПЦР может иметь два результата:

  1. Положительный ответ анализа, указывающий на наличие инфекции. (Если результат положительный на 95 %, то можно с уверенность говорить о том, что инфекция parvum присутствует. Низкий показатель (не 100 %) обусловлен человеческим фактором – нарушена техника проведения исследования или имело место неправильное хранение реактивов).
  2. Отрицательный результат после сдачи анализа говорит о том, что следы parvum инфекции отсутствуют.

Количественный анализ выявляет как сильно организм загружен инфекцией. Чем выше содержание комплектов ДНК, тем тяжелее и сложнее протекает parvum инфекция и вызванное ими заболевание.

История

ДНК технология в виде этого метода и его открытие стало одним из самых выдающихся и полезных достижений последних десятилетий. Можно сказать, что ПЦР – это прорыв в области молекулярной биологии. Светлую голову американского биохимика Кэри Мюллиса посетила такая простая, но в то же время гениальная мысль о том, как получить копии ДНК в неограниченных количествах.

Благодаря своей идее ученый был удостоен Нобелевской премии. Правда спустя 8 лет после фактического открытия.

В основе метода — амплификация фрагмента ДНК. Для того чтобы получить из одной молекулы ДНК 100 миллиардов сходных молекул, потребуется лишь обычная пробирка, реагенты, источник тепла. Материалом может послужить волос, капля крови или слюна. Сам способ обнаружения инфекции настолько тривиален и легко выполним, что многие удивились – почему раньше никто не додумался до этого.

Принцип действия

Биологический материал (например, кровь, мазок и т.д.) помещается в реактор. К нему добавляются ферменты, которые помогают синтезировать копию ДНК. Далее осуществляется принцип цепной реакции: из одной молекулы образуется две, из двух четыре, из четырех восемь и так пока не появится сотни тысяч копий. Полученный результат легко анализируется специалистами.

У метода есть свои недостатки и преимущества. К плюсам относится:

  • Высокая чувствительность. Это значит, что проблема будет обнаружена даже если у потенциального пациента присутствует единственная клетка вируса, бактерии, то есть на самой ранней стадии.
  • Быстрый результат. Полная диагностика проводится за рекордно короткий срок – 3-5 часов.
  • Прямое определение всех возбудителей ИППП.
  • Универсальность анализа заключается в том, что для его проведения пригодны любые материалы (не только «стандартные» кровь и слюна, но даже мокрота, эякулят, кал и др.).
  • Специфичность. При проведении этого анализа в представленном материале выделяется элемент ДНК типичный только для одного определенного возбудителя.
  • Этим способом диагностируются различные инфекции. И не только на запущенной острой стадии, но и на начальной.

Достоинства ПЦР самоочевидны, но у исследования есть и минусы:

  • Иногда пациент получает положительный результат будучи совершенно здоровым. Если разбирать на элементарном примере, то такое случается даже тогда, когда инфекция уже «безжизненная» (уничтожена антибиотиками). ПЦР не способен отличать живые клетки от неживых, следовательно, когда забранный для анализа материал еще не обновлен и в нем присутствуют «больные» клетки, ПЦР распознает несуществующую инфекцию.
  • Микробы обладают одной интересной особенностью – меняться («мутировать») с течением времени.

Какие заболевания выявляет ПЦР

  1. Все виды гепатитов
  2. Герпесвирусы
  3. ВИЧ-инфекция
  4. ИППП (parvum, хламидиоз, трихомониаз, и т.д.
  5. Туберкулез
  6. Кандидоз
  7. Папилломавирусная инфекция
  8. Клещевой энцефалит

И многое-многое другое.

Использование в медицине и генетике

В области медицины ПЦР применяется для обнаружения не только инфекционных, но и генетических заболеваний. Также копирование ДНК позволяет установить отцовство.

Цепная реакция успешно и активно используется в криминалистической практике. Если судмедэкспертам удалось обнаружить на месте преступления какие-либо генетические материалы (кровь, слюна, волосы и т.д.), то можно выявить – идентичны ли они с такими же материалами, взятыми у подозреваемых.

Перспектива развития ПЦР

  • Главное направление – инфекционные заболевания.
  • Диагностика раковых заболеваний имеет небольшое, но постоянно растущее количество информации о генах, связанных с опухолевыми заболеваниями.
  • Диагностика генетических заболеваний развивается также – ускоренными темпами. В будущем это позволит начать лечение болезни до появления характерных симптомов.
  • Самую скромную нишу занимает диагностика патогенов в пище. Но по оценкам экспертов ожидается возрастание ДНК-диагностики и в этой области.

Интересные случаи и факты

  • ДНК любого человека на планете совпадает на 99,9 процентов и лишь оставшиеся 0,1 уникальны.
  • ДНК Homo sapiens на 50% совпадает с ДНК экзотического фрукта – банана.
  • Немецкие сотрудники городской администрации предложили один интересный метод для борьбы с … собачьими экскрементами. Суть его заключается в создании специальной базы, которая будет хранить образцы ДНК всех собак, проживающих в городе. При таком подходе составить портрет «злостного правонарушителя» будет несложно. Домашний питомец идентифицирован, владелец наказан огромным штрафом. Вокруг чистота и порядок.
  • У каждого человека есть один интересный ген – hDEC2. Он становится интересным тогда, когда мутирует. У его обладателя исчезает потребность в длительном сне, и он прекрасно высыпается за три-четыре часа. Эти счастливые люди способны многого добиться в жизни, потому что получили роскошный подарок – время. Известно, что мало спала Маргарет Тэтчер, Норма Джим Бейкер, Наполеон, правда неясно — была ли это мутация или же какая-то другая индивидуальная особенность.

Смотрите также