Иммуноферментный анализ ифа


Иммуноферментный анализ: область применения и суть, ИФА-диагностика на примере сифилиса, ВИЧ и других вирусов

Иммуноферментный анализ (ИФА-диагностика) — современный метод лабораторного диагностирования, который идентифицирует специфические антитела крови и антигены определенной болезни.

[list h3 h4]

Данный метод используется в медицине с 1960 годов. Изначально он имел очень трудоемкую специфику исследования, поэтому его массовое применение считалось затруднительным. Благодаря усовершенствованию микротехнологий, открытию новых биополимерных материалов, стало возможным использование ИФА массово. Это произошло в 1980 году. В первую очередь ИФА-анализатором были оборудованы центры переливания крови и венерологические отделения.

Область применения ИФА

Применение иммуноферментного анализа очень обширно, а область его применения охватывает почти всю медицину. Особенно важен ИФА в онкологии, когда возможно определить начало заболевания на самых ранних стадиях.

В клинической диагностической лаборатории существует множество панелей иммуноферментного анализа для выявления и ранней диагностики инфекционного процесса, гормональных сбоев, аутоиммунных заболеваний, венерических болезней. ИФА-диагностикой пользуются при тестировании лекарственных препаратов, их воздействия на организм человека. Область применения ИФА-диагностирования весьма обширна и может применяться для выявления:

  • нарушения репродуктивной функции;
  • нарушения в щитовидной железе;
  • нарушения иммунной системы;
  • инфекционные заболевания;
  • маркеры онкологических заболеваний.

И это список самых распространенных анализов. Полный список иммуноферментного анализа довольно большой и постоянно обновляется.

Суть ИФА-диагностирования

Иммуноферментный анализ состоит из двух компонентов: иммунной реакции и ферментативной реакции. Эти обе части данного метода работают сообща. Иммунная реакция находит болезнетворные микробы и микроорганизмы, а ферментативная реакция переводит полученные результаты в измеримую форму. Совмещаясь эти обе реакции, являют собой собственно сам ИФА.

[su_youtube_advanced url=»https://www.youtube.com/watch?v=-Z0hoaIPmS4″ width=»560″ https=»yes»]

ИФА различают как прямой и непрямой, конкурентный и неконкурентный. При прямом ИФА берут антитела к нужному антигену и соединяют между собой ферментативной реакцией. При непрямом методе ИФА производится двойной контроль.

В организме антитела (иммуноглобулины) вырабатываются как ответ на обнаружение вируса, микроорганизма или бактерии. Иммуноглобулины бывают разных видов: IgA, IgE, IgD, IgM, IgG. При определении того или иного вида иммуноглобулина применяется полистироловая панель. В лунках панели приготовлен чистый антиген. Вступая в реакцию с сывороткой крови, антиген и иммуноглобулин образуют особый антиген. На следующем этапе, благодаря образовавшемуся особому антигену, происходит появление иммунных комплексов. В результате чего в лунках планшета окрашивается вещество, насыщенность цвета которого зависит от числа антител пациента.

Все тест-системы для проведения иммуноферментного анализа проходят тщательную диагностику и укомплектацию необходимыми реагентами. При проведении ИФА нужно сверять результат с конкретной тест-системой, на которой проводится анализ, так как у каждой тест-системы свои показатели.

Результаты ИФА-диагностики на примере сифилиса

Чтобы определить наличие сифилиса, необходим иммуноферментный анализ. Кровь пациента берется из вены, натощак. Для проведения анализа используется панель со специфичностью АТ классов A, M, G. Антитела при сифилисе производятся в конкретной последовательности, поэтому благодаря ИФА можно точно определить, когда настало заражение и какая стадия болезни на данный момент у пациента. На планшете ответ на анализ на сифилис будет иметь следующий вид:

  • отрицательный результат оставит лунки бесцветными;
  • положительный результат окрасит лунки в желтый цвет.

Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна зависимости связанных между собой антигенов и антител.

ИФА-диагностирование на ВИЧ-инфекции

В мире, где заразиться ВИЧ (Вирус иммунодефицита человека) возможно даже от похода к зубному, очень остро стоит вопрос о диагностики этого заболевания. Сейчас пройти исследования крови на ВИЧ возможно в анонимной лаборатории. Кровь берется из вены. Целесообразно проводить ИФА-диагностику на ВИЧ после переливания крови, полового акта без презерватива и т.д. Обязательно стоит учитывать инкубационный период заболевания. Он может составлять от 40 до 95 дней.

Существует два вида ВИЧ-инфекции: ВИЧ1 и ВИЧ2. ИФА выявляет антитела класса G уже в позднем течении болезни. Для ранних сроков определения ВИЧ используются рекомбинантные тест-системы, где антитела класса А и М выявляют болезнь.

Если все-таки определяется ВИЧ, то для постановки окончательного диагноза проводится тщательное лабораторное обследование. Кровь из первого забора подвергается повторной перепроверке на новой тест-системе. Если положительный результат повторяется, кровь у пациента берется повторно и тестируется. В случае повторного положительного результата, кровь тестируют особо чувствительной тест-системой 3 раза подряд. Если результаты теста повторяются, проводят иммуноблотинг и только после этого дается окончательный ответ.

ИФА-диагностика на хламидии, цитомегаловирус, паразиты

Такие серьезные заболевания, как цитомегаловирус и хламидиоз, возможно определить иммуноферментным анализом с точностью до дня инфицирования, а также в какой стадии данное заболевание сейчас находится, какое лечение будет наиболее эффективно.

Когда в анализе определяется хламидия, появляются антитела класса А, М, G:

  • антитело (IgM) определяется в первые дни инфицирования;
  • антитело (IgA) определяется после 30 дня инфицирования;
  • антитело (IgG) определяется независимо от времени инфицирования. Иммуноглобулины этого вида находятся в организме и помогают отслеживать лечение.

С цитомегаловирусом сложнее. ЦМВ проявляется в IgM, когда заболевание уже циркулирует в организме больше месяца. И наоборот — IgG определяет развитие начальной (острой) стадии болезни или повторное реинфицирование вирусом. При исследовании иммуноферментного анализа на IgG необходимо учитывать авидность антитела IgG. Если антитело низкоавидное, это значит, инфекция находится на первичной своей стадии. Высокоавидный IgG показывает хроническую форму заболевания, также это показывает сформированный устойчивый иммунитет.

Наличие паразитов в организме очень опасно. Существуют такие виды вирусов, определить которые можно только посредством ИФА-диагностики. Иммуноферментный анализ определяет наличие паразитов, даже если они пребывают в форме от цисты до взрослого гельминта. По анализу крови, можно определить наличие инфекции в любом органе. Организм человека выделяет антитела в ответ на инородные антигены, что и покажут результаты диагностики методом иммуноферментного анализа.

Благодаря изобретению иммуноферментного анализа люди получили возможность диагностировать огромное количество опасных заболеваний. Сейчас можно сдать кровь (берется только кровь из вены) в любой диагностической лаборатории и получить достоверный результат в короткие сроки.

Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс.

В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область медицинских знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. За последние десять лет получил широкое распространение и внедрение в массовую практику метод клинической лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ. Вообще технологии иммунологических ферментативных и радиологических реакций широко использовались в типировании клеток, культур клеток, различных тканей с начала 80-х годов XX столетия. Однако методы эти были очень трудоемкими, не унифицированными, не стандартизированными, что исключало их использование в лечебно-диагностических целях в массовом порядке. Такими методами пользовались лишь узкие, наукоемкие и высокоспециализированные лаборатории.

Однако с развитием техники, микротехники, производства различных биополимерных материалов стало возможным производить готовые наборы иммуноферментной диагностики, которыми смогут пользоваться лаборатории лечебно-профилактических учреждений широкого профиля. ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, сифилис, цитомегаловирус, токсоплазмоз, герпес и т.д.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями. Давайте постараемся разобраться, что это за метод, и какие принципы лежат в его основе?

  Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов – иммунной реакции и ферментативной реакции. Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками. Исходя из такой структуры метода иммуноферментного анализа, разберем обе его части по отдельности. Что такое иммунная реакция? Что такое антиген? В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции. Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются антигены. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).

Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?

Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!

Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.

Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».

Как происходит узнавание антигена?

Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!  

 Что такое антитело, иммунный комплекс?

А что представляет собой антитело? Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.

Что такое иммунный комплекс?

При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс. С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.

Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)

Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины.

Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM. Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей. Какая реакция – ферментативная? Что такое сродство, субстрат и продукт реакции? Перейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.

Что такое ферментативная реакция?

Ферментативная реакция

– это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.

Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия.

Колориметрия применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость. При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (калибровочный график). Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.

В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.

Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.

В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.

Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом

Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

Удаление «лишних» антител

Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения

Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу. В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом

Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело

После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения

После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.

Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.  
Гормоны и маркеры заболеваний щитовидной железы Тиреопероксидаза (ТПО)
Тиреоглобулин (ТГ)
Тиреотропный гормон (ТТГ)
Тироксин (Т4)
Трийодтиронин (Т3)
Свободный тироксин (Т4)
Свободный трийодтиронин (Т3)
Диагностика репродуктивной функции Лютеинизирующий гормон (ЛГ)
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)
Хорионический гонадотропин (ХГ)
Пролактин
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
Кортизол
Стероид связывающий глобулин (ССГ)
Альфафетопротеин (АФП)
Онкомаркеры Хорионический гонадотропин (ХГ)
Простатспецифический антиген (ПСА)
СА – 125
СА – 19.9
CYFRA – 21-1
М – 12 (СА – 15.3)
MUC – 1 (M – 22)
MUC1 (M – 20)
Альвеомуцин
К – цепь
L – цепь
Фактор некроза опухолей (ФНОα)
γ – интерферон
Раково-эмбриональный антиген (РЭА)
Диагностика инфекционных заболеваний Токсоплазма (IgG, IgM)
Краснуха (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Герпес (IgG, IgM)
Туберкулез (IgG, IgM)
Корь (IgG, IgM)
Гепатит Д, Е, А (ВГД, ВГЕ, ВГА)
Гепатит С (ат ВГС, ВГСсore)
Гепатит В (НВs, НВе НВсore)
Уреаплазма (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG, IgM)
Хламидия (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG)
Сифилис (IgG)
Аспергиллёз (IgG)
Лямблии (IgG)
Helicobacter Pylori (IgG)
Псевдотуберкулез (IgG, IgM)
Кандида (IgG)
Герпес (IgG, IgM)
Эпштейн-Барр (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Диагностика аутоиммунных заболеваний и определение иммунного статуса IgE – общий
С-реактивный белок (СРБ)
Глиадин (IgG, IgA)
IgG4
Общий IgG
IgG2
Общий IgA
Секреторный IgA
Общий IgD
Общий IgМ
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
Маркеры заболеваний сердца Тропонин I
  В таблице приведен далеко не полный перечень анализов (только наиболее распространенные), выполняемых с помощью иммуноферментного анализа. Привести же весь список не представляется возможным, поскольку он будет очень большим и постоянно пополняющимся. Помимо лабораторной диагностики метод иммуноферментного анализа широко используется в научных исследованиях.

Автор: Наседкина А.К.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) – современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни. Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);3) исследование гормонального статуса пациента;4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:

1) Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Основные понятия

Перед тем, как прояснить суть метода ИФА, кратко разберемся в некоторых понятиях.Антитела (или иммуноглобулины - Ig) – специфические белки, вырабатываемые B -лимфоцитами (иммунные клетки) в ответ на попадание в организм какого-либо инфекционного патогена (вирусы, бактерии, грибы и др). Выделяют иммуноглобулины А (IgA), иммуноглобулины Е (IgE), иммуноглобулины М (IgM), иммуноглобулины G (IgG), иммуноглобулины D (IgD). Отличаются они друг от друга молекулярной формой и массой, периодом полураспада, участием/неучастием в инфекционных процессах, сроками обнаружения с момента инфицирования. Если рассмотреть молекулярный вес, то больше всего он у IgM – это пентамер (950 000 дальтон) в отличие от остальных Ig (от 150 до 200 000 Да), благодаря чему IgM просто не могут проходить через плацентарный барьер. Поэтому обнаружение IgM у ребенка 1 года жизни всегда является признаком наличия инфекции у плода. В сыворотке крови основная масса иммуноглобулинов представлена именно IgG (75-85%), а самая низкая - IgE (0,003%). В инфекционном процессе непосредственное участие принимают только IgA, M, G. IgE являются признаком аллергических реакций и заболеваний, а IgD – можно обнаружить лишь в ткани лимфоузлов и миндалин, играет роль в формировании местного иммунитета.

Классы иммуноглобулинов

Антигены – высокомолекулярные вещества органического происхождения, в частности возбудителей инфекционных и других заболеваний, а также вещества различных измененных клеток, образующихся при той или иной болезни (аутоиммунные заболевания, онкология).

Иммунный комплекс – комплекс антиген-антитело, участвующий в иммунном процессе.

На чем основан метод ИФА.

Выделяют несколько разновидностей ИФА (прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный), однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Суть метода ИФА

Простым языком этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1) На поверхности лунок планшета доктора, проводящего обследование, находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении биологического материала (сыворотки крови) пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Это соединение будет выступать «особым антигеном» в следующем этапе.

2) На данном этапе идет образование ИК (иммунных комплексов) - реакция между «особым антигеном» и конъюгатом (это иммуноглобулин, меченый ферментом пероксидазой). Добавляется особый хромоген. Результатом такой ферментативной реакции является образование окрашенного вещества в лунке планшета, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в материале пациента иммуноглобулинов (антител).

3) Далее происходит оценка результата: фотометрирование с помощью многоканального спектрофотометра, сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб, математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Обычно на практике используют 96 луночные планшеты.

При измерении оптической плотности (ОП) исследуемой жидкости подсчитывается количество (или концентрация) антител в определенной единице объема. Затем результат сравнивается с контрольным образцом.

Нужно помнить:для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии (то есть «референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования. Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При постановке реакций ИФА имеет значение и такое понятие как авидность антител. Авидность антител – это прочность связи антитела с антигеном и то количество антигена, находящегося во взаимосвязи с иммноглобулинами (антителами). Авидность имеет большое значение при оценке предполагаемого срока инфицирования, что чрезвычайно важно при диагностике первичного инфицирования у беременных.

Основа теста на авидность антител состоит из обработки иммунного комплекса (антиген-антитело) раствором мочевины с целью разрушения белка. Высокоавидные связи остаются целыми, а низкоавидные разрушаются. Результат выдается в виде индекса авидности, выражаемого в процентах (%).

Какие заболевания выявляются с помощью ИФА-диагностики?

1. Инфекционные заболевания1.1 Вирусные гепатиты А (IgM, G), В антигены -HBsAg, HBeAg, антитела - IgM HBcorAg, Ig суммарные HBcorAg, IgG HBeAg), С (антитела Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G) и другие.1.2 ВИЧ-инфекция (IgG)1.3 Цитомегаловирусная инфекция (антитела IgM, G)1.4 Эпштейн-Барр инфекция или мононклеоз (антитела IgM, G к EA, VCA, NA белкам вируса)1.5 Герпетические инфекции (антитела IgM, G)1.6 Токсоплазмоз (антитела IgM, G)1.7 Краснуха (IgM, G)1.8 Корь (IgM, G), Бруцеллез (IgM, G), Псевдотуберкулез (IgM, G), Салмонеллез (IgM, G), Шигеллез или дизентерия (IgM, G), Аспергиллез (IgM, G), Клещевой энцефалит, Боррелиоз и многие другие.1.9 Паразитозы (лямблиоз, токсокароз, трихинеллез, описторхоз, эхинококкоз, альвеококкоз и другие), при которых выявляются IgG1.10 ЗППП (заболевания, передающиеся половым путем) – Микоплазмоз (IgM, G), Уреаплазмоз (IgM, G), Хламидиоз (IgA, M, G), Сифилис (IgG)

1.11 Хеликобактерная инфекция (IgG)

2. Маркеры аутоиммунных заболеваний и показатели иммунитета человека (общий IgE, общий IgG, общий IgA, общий IgM, общий IgD, секреторный IgA, IgG 2, IgG4, ЦИК-циркулирующие иммунные комплексы, IgA и IgG к глиадину и другие)

3. Онкологичсекие маркеры (ФНО – фактор некроза опухоли, РЭА – раково-эмбриональный антиген, ПСА – простатспецифический антиген, ХГ – хорионический гонадотропин, СА 125, альвеомуцин и многие другие)

4. Репродуктивные нарушения (эстрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, АФП- альфафетопротеин, ФСГ – фолликулостимулирующий гормон и другие)

5. Заболевания щитовидной железы (свободные и связанные Т3, Т4, тиреоглобулин, тиреопероксидаза – ТПО, тиреотропный гормон - ТТГ).

Данный список представлен далеко не всеми заболеваниями, которые диагностируются с помощью иммуноферментного анализа.

Материал для ИФА анализа и правила его забора

Наиболее распространенный материал для реакции ИФА – это сыворотка крови пациента, взятая натощак. Материалом также могут служить спинномозговая жидкость, околоплодные воды, содержимое стекловидного тела, слизь цервикального канала и уретры, мазки.

Подготовка пациентов к сдаче материала для ИФА

Кровь забирается натощак. Перед сдачей крови не нужно принимать никакие препараты. Специфическое лечение (антибактериальное, противовирусное, противопаразитарное и прочее) нужно прекратить не менее, чем за 2 недели до исследования.

Сроки изготовления ИФА

Иммуноферментный анализ материала проводится быстро, в течение суток. Задержки могут быть в разных лабораториях из-за накопления определенного количества сывороток.

Возможные результаты ИФА-диагностики

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции (есть она или нет), но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител (иммуноглобулинов - Ig)?

Самыми ранними антителами являются IgM. Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM – активация (или обострение) хронического процесса. Антитела IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

Современные тест-системы обладают высокой чувствительностью, вследствие чего встречаются неспецифические ложноположительные результаты (нередко у беременных). Поэтому у данной группы пациентов положительные IgM нужно перепроверять!

Антитела IgA появляются через 2-4 недели после инфицирования, но в количестве, достаточном для обнаружения – через месяц. Сывороточные IgA синтезируются плазматическими клетками селезенки, лимфоузлов и слизистых оболочек,Секреторные IgA концентрируются на слизистых оболочках для выполнения своей защитной функции – участвуют в местном иммунитете.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG. При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях (микоплазмоз, хламидиоз, трихомониаз) уровень IgG не бывает высоким, снижается существенно из-за отсутствия иммунитета при данных инфекциях.

Варианты обнаружения антител разных классов:

- Изолированное обнаружение антител IgM предполагает наличие первичногоинфицирования.- Одновременное выявление в крови IgM и IgG характерно для первичного инфицированияв предыдущие 2-3 месяца, а также при обострении хронического заболевания. Следовательно, при беременности наличие IgM не всегда является признаком первичного инфицирования.- Выявление изолированно IgG может указывать как на иммунитет к данному заболеванию,так и на хроническую инфекцию. Во второй ситуации имеет значение и количество антител (титр), и изменение этого титра в динамике. Обычно исследования проводят с интервалом в 2-4-6 недель.- Обнаружение IgA изолировано или с IgM указывают на первичную инфекцию. При

появлении IgA вместе с IgG предполагается активация хронической инфекции (в среднем 2 недели от момента обострения).

Определение авидности антител IgG является прекрасным дополняющим этапом диагностики первичной инфекции от давнего заражения, что имеет свое клиническое значение, прежде всего, при оценке риска внутриутробного заражения плода. Обнаружение низкоавидных IgG указывает на первичную инфекцию и выявляются в среднем спустя 4-6 месяцев после инфицирования, реже дольше. Низкоавидные IgG требуют других лабораторных подтверждений первичного инфицирования (IgM). Высокоавидные антитела являются либо признаком хронического заболевания и его обострения, либо сформировавшегося иммунитета.

Особенности у детей грудного возраста:у детей до года, а иногда и 1,5 лет в крови циркулируют материнские IgG к разным инфекциям (то есть произошло их проникновение через плаценты от матери к плоду в период внутриутробного развития). Она не являются сами по себе признаком наличия инфекции в настоящем. Если же в такjм возрасте обнаруживаются IgM (напомним, что материнские IgM проникнуть через плаценту не могут), то это признак внутриутробного инфицирования или приобретенной после рождения инфекции.

Количественный ИФА-метод

Результат ИФА-диагностики (с помощью иммуноферментного анализатора) выдается в определенных единицах измерения:- Оптическая плотность (ОП) пробы – концентрация специфических антител в единице объема. Чем выше ОП пробы, тем выше концентрация антител. В некоторых результатах говорится о коэффициенте позитивности (КП) – это тоже оптическая плотность образца.- Единицы концентрации антител (нанограмм/ миллилитр или нг/мл). - В виде титров сывороток: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и так далее. Диагностические титры (при которых ставится диагноз именно болезни, а не факт инфицирования) для разных болезней разные.- В виде символов – «+», «-», «?» (+, ++, +++, ++++).

- В виде качественной оценки по заданному критерию (положительно или отрицательно).

Правильно оценить количество антител, вариант классового выявления иммуноглобулинов, а, следовательно, выставить стадию болезни и необходимость лечения может только врач.

Нельзя забывать, что для любой тест-системы разрабатываются свои «референтные значения» (варианты нормы), при превышении которых и диагностируется то или иное заболевание (варианты патологии). Для разных тест-систем «референтные значения» различные.

Корректное сравнивание результатов ИФА, взятых в динамике, возможно только в случае их изготовления в одной и той же лаборатории.

Врач инфекционист Быкова Н.И.

Иммуноферментный анализ крови

Иммуноферментный анализ крови – это высокоэффективная и современная методика клинической диагностики целого ряда заболеваний. Суть данной методики состоит в выявлении активности определенных антител. ИФА крови используется не только лишь для определения существующих патологий человеческого организма, а и в ходе экспериментальных исследований, где требуется особая точность определения процентных концентраций соединений в биологическом материале.

Принцип диагностики

Иммуноферментный анализ — это выявление специфических антител посредством биохимических реакций. Если человек заболевает, и в его организм попадает чужеродный агент (антиген), то иммунная система начинает активно вырабатывать особые белки или антитела, которые уничтожают антигены. В результате их «столкновения» образуются соединения антиген-антитело.

Именно на их количественный и качественный анализ направлены иммуноферментные исследования. К примеру, если в процессе диагностики нужно выявить конкретный вирус в биоматериале крови пациента, то в нее добавляют антитела, которые считаются специфическими к вирусу.

И наоборот, ИФА реакция на выявление антител заключается во введении в образцы крови определенных антигенов. Особые реагенты ИФА используются в диагностике для того, чтобы сделать биохимическую реакцию более четкой.

Человеческому организму также свойственны неспецифические факторы защиты. Неспецифические антитела — это белки, которые действуют губительно на большое количество вредоносных микроорганизмов. Их не используют при проведении ИФА.

Показания к проведению

ИФА исследование проводят по рекомендации врачей в следующих случаях:

  • Определение патологий инфекционного характера, которые попадают в организм пациента преимущественно половым путем. Точная диагностика инфекций типа уреаплазмоза, трихомониаза или микоплазмоза.
  • Анализ на гормоны в сыворотке крови. Чаще всего анализы определяют тестостерон, прогестерон, тиреотропный гормон, пролактин. Это также относится к диагностике заболеваний органов эндокринной системы.
  • Выявление маркеров онкологического типа.
  • Идентификация различных соединений и установление причины интоксикации человека при укусах змей или отравлениях.
  • Диагностика инфекционных болезней, локализованных в разных органах и системах организма, установление тяжести и стадии патологического процесса. Анализ ИФА определяет такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты всех групп, корь, краснуху, хеликобактерную инфекцию.

Варианты проведения

В современной медицине иммуноферментное исследование применяют в двух вариантах: твердофазном и гистохимическом. Последний вариант используют в диагностике крайне редко. Материалом для исследования в этом случае может быть мазок ИФА, группы клеток, срезы парафиновые или отпечаток диагностируемых органов.

Твердофазный ИФА – это метод анализа, при котором один из участвующих в реакции компонентов (либо антитело, либо антиген) фиксируется на специальном твердом носителе. Это могут быть шарики, микропанели или палочки из полистирола. Данный иммунохимический метод — это гарантия идентификации и обнаружения антигена. Во время диагностики также можно будет выявить характерные антитела и выделить их титр в кровяной сыворотке.

Существует прямой и непрямой способ твердофазного исследования. Для выявления антигенов в лаборатории используют прямой метод, который также имеет название сэндвич метод. Для его осуществления берутся антитела, специфические к выявляемому антигену. Их помещают в лунки микропанели, куда позже вносится и сам антиген. Содержимое нагревают до 37 °С и выдерживают определенное время до самого введения помеченных ферментом антител.

Добавление раствора серной кислоты вызывает химическую реакцию. При положительном результате образцы окрасятся в оранжевый или желтый цвет. Анализ на наличие антител и определение их титра выполняют непрямым твердофазным ИФА.

Виды иммуноглобулинов, которые определяет анализ

Классификация состоит из 5 основных типов иммуноглобулинов человека: IgA, IgG, IgE, IgM и IgD. Для медицины большое практическое значение имеют лишь несколько из них (А, G, М).Иммуноглобулин класса А (или IgA) выполняет функцию защиты от инфекций слизистых, желудочно-кишечного аппарата, мочевыделительной системы и органов дыхания. В начале недуга выявить данные иммунные комплексы не представляется возможным, они проявляют себя только на 2 неделе заболевания или позже.

Иммуноглобулины IgM характеризуют острую фазу патологического процесса в организме. Их можно идентифицировать в крови уже на 5 сутки болезни. Анализ ИФА при беременности в некоторых случаях выдает завышенный показатель IgM, что не всегда является показателем инфицирования.

Иммуноглобулины класса G (или IgG) выявляют остаточный иммунный процесс. Первое их появление в образце крови приходится на 5-6 неделю болезни. Потом IgG могут присутствовать в течение всей жизни пациента, защищая его от рецидива заболевания и даже полностью исключая вторичное развитие патологий. При выявлении маркеров иммунной системы и аутоиммунных патологических процессах показатели IgG отличаются по своей природе. Например, Igg от Igg4 отличается тем, что первый иммуноглобулин общий, а второй – секреторный.IgE используют только в исследованиях паразитологии.

Иммуноглобулин IgD локализуется в лимфоцитах. В небольшой концентрации его можно обнаружить в крови каждого здорового человека. Количество этого компонента резко возрастает во время вынашивания ребенка, поэтому анализ на ИФА при беременности имеет некоторые отклонения. IgD повышен у больных астмой и людей с иммунодефицитом.

Проведение диагностики

Материалом для проведения ИФА служит венозная кровь, которая забирается из локтевой вены пациента. Рекомендуемый объем – 5-10 мл. Как только материал будет взят, его отправляют в диагностическую лабораторию.

Если все правила были соблюдены, то результат предоставят уже на следующий день.

Чтобы результат ИФА был достоверным, врачи настоятельно рекомендуют выполнить следующие правила подготовки:

  1. сдавать анализ на ИФА разрешается только натощак.
  2. последний прием пищи должен произойти за несколько часов до сна (исключить стоит жирные, копченые и мясные продукты).
  3. за несколько суток до визита в лабораторию нужно отказаться от приема препаратов.
  4. перед процедурой нельзя курить или употреблять любой алкоголь.
  5. запрещается накануне сдачи крови изнурять организм физическими нагрузками.

Расшифровка результатов качественного ИФА-метода

В ответе на ИФА по качественному методу возможны два вида результата:

  • отрицательный значит, что антител в собранной порции крови не обнаружено (отсутствие инфекционного процесса);
  • положительный – свидетельствует о выявлении антител (есть высокая вероятность патологического заболевания, вызванного инфекционным возбудителем).

Если изучение образца показало отрицательное значение иммуноглобулинов групп М, G и А, то можно сказать либо об отсутствии недуга, либо о начальной стадии его развития. Такой же результат бывает у пациентов при окончательном выздоровлении, когда прошло уже достаточно большое количество времени.

Повышенный положительный титр IgM при значениях IgA и IgG со знаком «-» свидетельствует о протекании в организме пациента острой фазы инфекционного недуга.Если результат показал положительные значения всех трех видов иммуноглобулина (М, G и А), то это говорит о рецидиве инфекционного недуга, которое находится в острой или хронической фазе развития.

Расшифровка результатов количественного ИФА-метода

Количественный метод определяет концентрации искомых веществ в образце крови. Полученный результат может выражаться в следующих единицах измерения:

  1. ОП – единицы измерения оптической плотности характеризуют уровень концентрации антител в единице объема. Чем она выше, тем больше иммуноглобулинов в биоматериале.
  2. Некоторые из применяемых ИФА-методик предполагают наличие такого показателя как индекс позитивности в анализе. Коэффициент позитивности — это обозначение, аналогичное плотности образца.
  3. Параметры концентрации антител выражаются в миллилитрах, нанограммах (или нг/мл).
  4. В виде присутствующих символов: «-», «+», «?» (+, ++, +++ и более).

Не стоит забывать, что достоверно оценить количество найденных иммуноглобулинов и поставить окончательный диагноз может только опытный врач.Каждая тест-система имеет свои референтные значения. Варианты нормы и варианты патологических отклонений у них различные.

Преимущества метода

  • Удобство и быстрота проведения биохимических реакций для диагностики;
  • Высокий уровень точности и чувствительность метода (составляет не менее 90%);
  • Возможность проведения диагностики даже на самой ранней стадии развития патологических процессов;
  • Уровень стоимости процедуры диагностики делает ее доступной для населения;
  • Возможность отслеживания динамики инфекционного процесса;
  • Абсолютная безопасность и относительная безболезненность;
  • Для получения достоверного результата хватает и минимального объема материала для исследования;
  • Бланк с ответом будет получен в кратчайшие сроки;
  • Существует возможность частичной или полной автоматизации процесса (полный цикл ИФА проводит анализатор лазурит).

Единственным недостатком считается то, что ИФА относится к непрямым видам диагностики.

То есть, дает возможность определить только иммунный ответ человеческого организма на наличие возбудителя, а не самого возбудителя.


Смотрите также